透射式熒光顯(xian)微鏡:激發光源是通過聚光鏡穿過標本材料來激發熒光的。常用暗視野集光器,也可用普通集光器,調節反光鏡使激發光轉射和旁射到標本上.這是比較舊式的熒光顯微鏡。其優點是低倍鏡時熒光強,而缺點是隨放大倍數增加其熒光減弱.所以對觀察較大的標本材料較好。
落射(she)式熒光顯微(wei)鏡:這是近代發展起來的新式熒光顯(xian)微(wei)鏡,與上不同處是激發光從物鏡向下落射到標本表面,即用同一物鏡作為照明聚光器和收集熒光的物鏡。光路中需加上一個雙色束分離器,它與光鈾呈45度角,激發光被反射到物鏡中,并聚集在樣品上,樣品所產生的熒光以及由物鏡透鏡表面、蓋玻片表面反射的激發光同時進入物鏡,反回到雙色束分離器,使激發光和熒光分開,殘余激發光再被阻斷濾片吸收。如換用不同的激發濾片/雙色束分離器/阻斷濾片的組合插塊,可滿足不同熒光反應產物的需要。此種熒光顯微鏡的優點是視野照明均勻,成像清晰,放大倍數愈大熒光愈強。
透射熒(ying)光(guang)顯微鏡(jing)的優點及缺點
光(guang)源:高壓(ya)汞燈或鹵素燈。
聚光(guang)鏡:使(shi)用暗場聚光(guang)鏡,使(shi)激發光(guang)和熒光(guang)分(fen)離(li)出(chu)來。
物鏡:可(ke)用任何種類(lei)的物鏡。
標本:因(yin)為是(shi)透射觀察,薄的標本比較適合。
優點:①由于用了暗場聚光鏡,激發光不能進入物鏡,因此容易形成暗的背景,得到良好的反差,且任何物鏡都可用于觀察。②用低倍物鏡時,比反射熒光顯微鏡更亮。
缺點:要正確調整聚光鏡中(zhong)心和高度,否則不(bu)(bu)(bu)能(neng)獲得(de)明(ming)亮的(de)熒(ying)光像。由于暗視(shi)(shi)場聚光鏡焦(jiao)距限制,不(bu)(bu)(bu)能(neng)使用厚(hou)的(de)載(zai)玻片。視(shi)(shi)場照明(ming)區不(bu)(bu)(bu)能(neng)過大,否則容易使熒(ying)光標(biao)本熒(ying)光色衰褪。厚(hou)的(de)或(huo)不(bu)(bu)(bu)透明(ming)的(de)標(biao)本不(bu)(bu)(bu)適用。
反射熒(ying)光顯微鏡的優點及缺點
光源:高壓汞燈或鹵素燈。
聚(ju)(ju)(ju)光(guang)鏡:因為物鏡作(zuo)為聚(ju)(ju)(ju)光(guang)鏡,所以不需要聚(ju)(ju)(ju)光(guang)鏡。
物鏡:所用物鏡要能透(tou)過(guo)足夠的紫(zi)外光,而且本(ben)身不產生熒光,對數值孔徑(jing)沒有限(xian)制(zhi)。
標(biao)(biao)本:厚的(de)標(biao)(biao)本或不透(tou)明的(de)標(biao)(biao)本都能觀察。
優點:①由于物鏡(jing)(jing)兼作聚(ju)光鏡(jing)(jing),不需要很(hen)多調節。②采用柯(ke)拉(la)照明法,可(ke)(ke)利用孔(kong)(kong)徑(jing)光闌(lan)和(he)(he)視場光闌(lan)的(de)效果。③物鏡(jing)(jing)數值孔(kong)(kong)徑(jing)不受限制,在(zai)高放(fang)大倍率時(shi),也(ye)可(ke)(ke)以獲得高分辨率的(de)像。④厚的(de)或不透(tou)明的(de)標本也(ye)能(neng)觀(guan)察(cha)(cha),厚的(de)蓋玻片也(ye)能(neng)使用。⑤其它觀(guan)察(cha)(cha)法也(ye)能(neng)與反射熒光結合(he)使用,特別和(he)(he)相(xiang)差(cha)法和(he)(he)透(tou)射微分干(gan)涉差(cha)法相(xiang)結合(he)。⑥可(ke)(ke)以避免不必要的(de)熒光色(se)衰褪現(xian)象。
缺點(dian):在用(yong)地倍率物鏡(jing)時,像比較暗,因此要(yao)用(yong)大數值(zhi)孔徑的物鏡(jing)。濾光鏡(jing)系統要(yao)有(you)效地分(fen)離開(kai)激發光和熒光。