熒光顯微(wei)鏡是(shi)利用特定波長(chang)的(de)光(guang)(guang)照(zhao)射被檢(jian)物體產生熒光(guang)(guang)進行鏡檢(jian)的(de)顯微(wei)光(guang)(guang)學觀測技術，已有(you)100多年(nian)歷(li)史。近(jin)年(nian)來，由于免疫(yi)熒光(guang)(guang)在(zai)醫學研究(jiu)、診(zhen)斷領域里的(de)廣泛(fan)應用，FISH、綠(lv)色熒光(guang)(guang)蛋白(GFP)技術分別在(zai)基因組學、蛋白質組學研究(jiu)方面的(de)推廣，顯微(wei)照(zhao)相、數字CCD成像技術的(de)輔助驅動，賦予這(zhe)一傳統技術更新的(de)應用價(jia)值(zhi)和(he)生命(ming)力(li)。

應用要點

1)預檢查(cha)和調節

(1)每(mei)次進行熒光觀測前，都要例(li)行檢查(cha)熒光(guang)裝置(zhi)的(de)燈絲對中、光(guang)路對焦(jiao)、孔徑(jing)光(guang)闌、視場光(guang)闌設(she)置(zhi)等狀況(kuang)。

(2)所需要的熒光激發/發射濾光片(pian)組件是(shi)否(fou)已裝在轉換器中，物鏡(jing)(jing)配置是(shi)否(fou)得當，除去物鏡(jing)(jing)前(qian)透鏡(jing)(jing)的油(you)漬和灰塵。

(3)如同時進行透射(she)光相差(cha)觀(guan)察，要檢查(cha)聚光鏡(jing)對中心及相差(cha)環與物(wu)鏡(jing)相反的共軛(e)情況。

(4)檢(jian)查樣品載體(載(zai)玻(bo)片(pian)、蓋(gai)玻(bo)片(pian)和其(qi)他(ta)器皿(min))有(you)否掛有(you)液體、灰塵，厚度是否在物鏡(jing)標定的工作距離范圍內(nei)。切片樣(yang)品不(bu)能太厚，約≤10μm為(wei)宜。

(5)因照(zhao)明光源含有紫(zi)外線，在載(zai)物臺前上方(fang)放一(yi)塊棕(zong)色遮光板(ban)，以防紫(zi)外線損傷視網膜。

(6)電(dian)壓(ya)不穩(wen)會降低高壓(ya)汞燈的使用壽命，光源(yuan)電(dian)源(yuan)ZUI好加(jia)配穩壓器。

(7)為(wei)延長(chang)汞燈(deng)壽命，在開啟后(hou)15min方(fang)可(ke)關(guan)閉；汞燈熒光電源一旦關(guan)閉，再次啟動至少需(xu)等待(dai)10min，以使水銀蒸(zheng)汽冷卻復(fu)至原態，否則會影響燈的壽(shou)命。

2)熒光(guang)鏡像觀(guan)察

(1)在(zai)開啟熒(ying)光燈(deng)源后約5～10min激發(fa)光(guang)強度趨于(yu)穩定，裝(zhuang)載樣(yang)品進(jin)行觀察(cha)；為防止在調(diao)焦和尋找物像過程中(zhong)過度激發(fa)光(guang)照會造成樣(yang)品熒光(guang)淬滅，先(xian)通過縮(suo)小(xiao)熒光(guang)照明器的孔(kong)徑光(guang)闌或加ND濾光(guang)片將激發光(guang)調(diao)節到適度強度，有規(gui)律地移動樣品(pin)臺(tai)，待確定鏡像后，在調(diao)節到很合適(shi)熒光狀(zhuang)態用于拍攝記(ji)錄。

(2)鏡(jing)像質量不佳的調整(zheng)。排除樣(yang)品制(zhi)備因素外(wai)，可進(jin)行的必(bi)要(yao)調節(jie)措施是(shi)：

①排除成像光(guang)路(lu)中的遮光(guang)或限(xian)光(guang)器(qi)件，如DIC附件、ND濾(lv)光(guang)片等。

②重新調(diao)節熒光照(zhao)明器的收光器對焦(jiao)和(he)孔徑光闌(lan)大小。

③細心調節物鏡覆蓋差校正(zheng)環。

④復查(cha)熒光激發/發射組件是否與所標記的(de)熒光(guang)色素(su)對應(ying)。

(3)在不影響分(fen)辨(bian)率的前提下，于(yu)照相取景框和(he)CCD靶面(mian)范(fan)圍之(zhi)外，可(ke)盡量回(hui)縮熒光(guang)(guang)光(guang)(guang)路視場光(guang)(guang)闌和物鏡(100X物鏡)的(de)數(shu)值孔徑光(guang)闌(lan)調(diao)節環，以(yi)避(bi)免(mian)雜散光(guang)的(de)影響、提高景深(shen)，并(bing)可(ke)減小激發面積防止附加樣品(pin)淬(cui)滅。

(4)暫時(shi)不觀(guan)察時(shi)，應阻斷激(ji)發光(guang)路。

(5)油(you)鏡(jing)觀察時(shi)，須用(yong)“無熒(ying)光油(you)”，尤其是在U、V激發時，因(yin)常規鏡檢(jian)用的香柏油帶有青(qing)色熒光。

3)熒光(guang)照相和數字CCD相機圖像(xiang)采集

(1)熒光照相

①盡管(guan)肉眼觀察熒光(guang)(guang)鏡像(xiang)亮度與(yu)普通明場(chang)相(xiang)差無幾，而實際上曝光(guang)(guang)時間(jian)要增加數倍甚(shen)至(zhi)幾十(shi)倍，應(ying)使用快速感光(guang)(guang)膠片，如ISO200(24DIN)、ISO400(27DIN)。

②根據熒(ying)光(guang)物像(xiang)在測(ce)光(guang)區的(de)分布比例和鏡像(xiang)的(de)明暗程度設置曝(pu)光(guang)補(bu)償調節，原(yuan)則上(shang)適當(dang)增補(bu)償，以獲得背(bei)景黑暗熒(ying)光(guang)圖像(xiang)明亮、鮮(xian)艷的(de)照(zhao)片效(xiao)果(guo)。

③如果(guo)沒有照明標(biao)線取景(jing)器，可先選擇(ze)較明亮的(de)熒光區(qu)域進行對(dui)焦調(diao)整。

④對點(dian)(dian)狀(zhuang)熒光(guang)物像或撲捉某點(dian)(dian)為主(zhu)的(de)拍攝，可選擇適當的(de)點(dian)(dian)測光(guang)模式。

⑤對在同(tong)一幅(fu)需要同(tong)樣條件拍攝的(de)分(fen)散點狀熒光物像，可試用點測光配合自動鎖定方式拍攝。

⑥曝光過(guo)程應避(bi)免(mian)任何振動，有條(tiao)件可配置防震臺。

(2)數字CCD相機(ji)圖像(xiang)采集(ji)

①光學接口的中(zhong)間倍(bei)率要與CCD的芯片尺寸合理匹配(pei)。

②采用合適(shi)的熒光拍(pai)攝模式，摸索減背景(jing)(Background Subtraction)處理(li)條(tiao)件，根據(ju)鏡像情況設置Binning、Gain、Gamma等(deng)參數。

③因CCD芯(xin)片靈敏度(du)較高，如(ru)果(guo)熒(ying)光鏡像過于明亮，為(wei)獲取對比度(du)較好的采集圖(tu)像，可適當縮小(xiao)熒(ying)光照明器孔(kong)徑光闌或(huo)加ND濾光片，特(te)別是在熒光輝(hui)光較強影(ying)響(xiang)拍攝樣品細節的(de)情(qing)況時(shi)。

實際工作中(zhong)，為獲得較好的(de)熒(ying)光圖像拍(pai)攝質量需要對上述(shu)調節機制的(de)綜合(he)運用，反復摸(mo)索、優化條(tiao)件(jian)。