2023年2月23日，北京大學程和平-王愛民團隊在 Nature Methods 在線發表題為《Miniature three-photon microscopy maximized for scattered fluorescence collection》 的文章。文中報道了重量僅為2.17克的微型化三光子顯微鏡，首次實現對自由行為小鼠的大腦全皮層和海馬神經元功能成像，為揭示大腦深部結構中的神經機制開啟了新的研究范式。

微型化三光子顯微鏡首次實現自由行為動物非侵入式深腦成像

海(hai)馬體(ti)位于皮層和(he)(he)胼胝體(ti)下面，在短(duan)期(qi)記憶(yi)到長期(qi)記憶(yi)的鞏固、空間記憶(yi)和(he)(he)情(qing)緒(xu)編碼等(deng)方面起重(zhong)要作用。在嚙齒類動(dong)物研究(jiu)模型(xing)中，海(hai)馬距離腦(nao)表面深(shen)度大(da)于一(yi)個(ge)毫米。由(you)于大(da)腦(nao)組織特別是(shi)胼胝體(ti)，具有對(dui)光的高散射(she)光學特性，所以突破成像深(shen)度極(ji)限(xian)是(shi)長期(qi)以來(lai)困擾神經科學家的一(yi)個(ge)極(ji)大(da)的挑戰。此前的微型(xing)化單光子及微型(xing)化多光子顯微鏡均無法(fa)實(shi)現(xian)穿透全皮層直(zhi)接對(dui)海(hai)馬區進行無損成像。

由(you)于(yu)腦組織是(shi)高散射介(jie)質，來自腦深層的(de)熒(ying)光(guang)信(xin)(xin)號達到(dao)表面時(shi)已經隨機散射。臺(tai)式三(san)光(guang)子顯微鏡使用(yong)(yong)工作(zuo)距(ju)離(li)大(da)于(yu)2mm、數值(zhi)孔徑(jing)1.0的(de)大(da)尺寸(cun)物鏡，在滿(man)足深層成像工作(zuo)距(ju)離(li)要(yao)求的(de)同時(shi)保持(chi)足夠的(de)熒(ying)光(guang)信(xin)(xin)號收集效率(lv)。但在微型探頭中，如(ru)果(guo)物鏡工作(zuo)距(ju)離(li)為2mm，使用(yong)(yong)大(da)數值(zhi)孔徑(jing)物鏡，探頭重量和(he)體積就比較大(da)，無(wu)法滿(man)足自由(you)行為小鼠(shu)對于(yu)探頭重量和(he)體積的(de)要(yao)求。

因此，解決這一問題的關鍵是在減小物鏡數值孔徑情況下，保持足夠的熒光收集效率。

此次微(wei)(wei)型(xing)化(hua)三(san)光子顯微(wei)(wei)鏡(jing)(jing)(jing)(jing)(jing)(jing)的(de)研發(fa)將(jiang)經典(dian)阿(a)貝(bei)聚(ju)光鏡(jing)(jing)(jing)(jing)(jing)(jing)結構(gou)(gou)(gou)引入探(tan)頭(tou)光學構(gou)(gou)(gou)型(xing)設計中，將(jiang)微(wei)(wei)型(xing)阿(a)貝(bei)聚(ju)光鏡(jing)(jing)(jing)(jing)(jing)(jing)與(yu)簡化(hua)的(de)無(wu)限(xian)遠(yuan)物(wu)鏡(jing)(jing)(jing)(jing)(jing)(jing)密接(jie)以提高散射熒光收集效率(lv)，同時在(zai)激發(fa)光路引入李斯特(te)物(wu)鏡(jing)(jing)(jing)(jing)(jing)(jing)作為(wei)管鏡(jing)(jing)(jing)(jing)(jing)(jing)補償簡化(hua)物(wu)鏡(jing)(jing)(jing)(jing)(jing)(jing)的(de)像差，并通過(guo)將(jiang)阿(a)貝(bei)聚(ju)光鏡(jing)(jing)(jing)(jing)(jing)(jing)與(yu)李斯特(te)管鏡(jing)(jing)(jing)(jing)(jing)(jing)部分復用，實現(xian)探(tan)頭(tou)體積的(de)減(jian)小。新(xin)微(wei)(wei)型(xing)化(hua)顯微(wei)(wei)鏡(jing)(jing)(jing)(jing)(jing)(jing)構(gou)(gou)(gou)型(xing)在(zai)工作距離1.75mm、數值(zhi)孔(kong)徑(jing)0.65、物(wu)鏡(jing)(jing)(jing)(jing)(jing)(jing)直徑(jing)僅(jin)3.4mm時，實現(xian)了與(yu)臺式三(san)光子顯微(wei)(wei)鏡(jing)(jing)(jing)(jing)(jing)(jing)熒光收集效率(lv)相當的(de)水平。

在全球，該微型化三光子顯微鏡首次實現了自由行為動物非侵入式深腦成像解決方案，可穿透小鼠大腦全皮層和胼胝體，實現對海馬CA1亞區的直接觀測記錄，避免植入式Grin Lens損傷腦組織。神經元鈣(gai)信(xin)(xin)號(hao)*大(da)成像(xiang)(xiang)深(shen)度可達1.2mm，血管成像(xiang)(xiang)深(shen)度可達1.4mm。同時，微型化(hua)三光子(zi)顯微鏡實(shi)現全皮層(ceng)鈣(gai)信(xin)(xin)號(hao)成像(xiang)(xiang)僅(jin)需幾毫瓦，海(hai)馬鈣(gai)信(xin)(xin)號(hao)成像(xiang)(xiang)僅(jin)需20-50mw，大(da)大(da)低于組織損傷的安全閾值。

嶄露頭角——2.2克微型化雙光子顯微鏡，實現自由行為小鼠腦成像

在多光子(zi)成像領域(yu)，這支(zhi)來(lai)自北大的團隊已深耕(geng)多年。

2017年，程和平院士領導的北大交叉團隊成功研制出**代2.2克微型化雙光子顯微鏡FHIRM-TPM，在全球首次實現了自由運動小鼠單個樹突棘水平神經元功能活動的高速、高分辨率實時成像。該微型化雙光子顯(xian)微鏡可(ke)(ke)實時記錄自由行為(wei)動(dong)(dong)物的(de)大腦神(shen)經元和樹突棘活動(dong)(dong)，支持鈣成像(xiang)，并可(ke)(ke)在(zai)同一(yi)視(shi)野長時程反復成像(xiang)。

此前(qian)，在用臺(tai)(tai)式(shi)(shi)雙光(guang)子(zi)顯微(wei)鏡研究活體小鼠腦活動時(shi)，需(xu)先麻(ma)醉小鼠并將其(qi)頭(tou)部固定。這種情況下，小鼠不能自(zi)由(you)運(yun)動，無法研究如(ru)打(da)斗、哺乳及社(she)交行為(wei)，懸尾實驗(yan)、電擊(ji)實驗(yan)等研究受限。此外，臺(tai)(tai)式(shi)(shi)雙光(guang)子(zi)顯微(wei)鏡不便移動且占(zhan)用面(mian)積(ji)較大。

隨著科技的(de)(de)(de)(de)發展(zhan)，部分研究人員引(yin)入虛(xu)(xu)擬現(xian)實(shi)技術，在(zai)(zai)小鼠面前放(fang)一個(ge)顯示器，并將小鼠放(fang)在(zai)(zai)跑(pao)(pao)步(bu)機上，在(zai)(zai)跑(pao)(pao)的(de)(de)(de)(de)過程中投(tou)放(fang)虛(xu)(xu)擬場(chang)景(jing)并觀察小鼠腦活動。但這種方法也飽受爭議。其一，在(zai)(zai)虛(xu)(xu)擬現(xian)實(shi)和現(xian)實(shi)情(qing)景(jing)中，小鼠大腦神經元的(de)(de)(de)(de)反應(ying)(ying)情(qing)況不一定完全相同；其二，動物在(zai)(zai)頭部固定的(de)(de)(de)(de)情(qing)況下會有情(qing)緒上的(de)(de)(de)(de)壓力(li)，還可(ke)能出現(xian)應(ying)(ying)激反應(ying)(ying)。

據吳潤龍介紹，北大團隊的微型化雙光子顯微鏡主要有以下幾方面突破，一是飛秒激光的柔性傳輸，普通的光(guang)(guang)纖在傳輸(shu)飛秒(miao)激(ji)光(guang)(guang)時具有很強的色(se)散和(he)非線性(xing)效應，導致(zhi)雙光(guang)(guang)子激(ji)發(fa)(fa)效率變(bian)低(di)，北(bei)大團隊開發(fa)(fa)了一種新型空心光(guang)(guang)子晶體光(guang)(guang)纖，可以(yi)無(wu)失真地傳輸(shu)920nm飛秒(miao)激(ji)光(guang)(guang)，從而高效地進行綠光(guang)(guang)熒(ying)光(guang)(guang)蛋白(bai)雙光(guang)(guang)子激(ji)發(fa)(fa)。

二是成像物鏡，傳統物鏡直徑在20mm左右，重量比一般小鼠還重，北大團隊開發的微型物鏡直徑為3.5mm、長10mm，內部有上十個鏡片組合，分辨率依然可以達到衍射極限；三是高速成像，為了(le)減少運動帶來的偽(wei)影(ying)，需要(yao)快速(su)地進(jin)行成像，北大(da)團隊(dui)通過高速(su)MEMS掃描振鏡，在(zai)微(wei)型(xing)(xing)化上實現了(le)視頻級的成像速(su)度。*后，各項技術的高質量(liang)集(ji)成，構成了(le)2.2g的高時(shi)空(kong)分辨(bian)微(wei)型(xing)(xing)化雙光子探頭。

全球范圍(wei)內，這款“戴著(zhu)跑”的微型化雙(shuang)光(guang)子顯(xian)微鏡**次(ci)實現了自由行為(wei)動(dong)物的清晰穩定(ding)成像(xiang)(xiang)，可用于在(zai)動(dong)物覓食、跳臺、打斗(dou)、嬉(xi)戲、睡眠(mian)等(deng)(deng)自然行為(wei)條件(jian)下，或者(zhe)在(zai)學(xue)習前、學(xue)習中(zhong)和(he)學(xue)習后，長時程觀察神(shen)(shen)(shen)經突(tu)觸、神(shen)(shen)(shen)經元、神(shen)(shen)(shen)經網絡、遠程連接的腦(nao)區等(deng)(deng)多(duo)尺度(du)、多(duo)層次(ci)動(dong)態變化，從而獲取小鼠在(zai)自由行為(wei)過程中(zhong)大腦(nao)神(shen)(shen)(shen)經元和(he)神(shen)(shen)(shen)經突(tu)觸活動(dong)的動(dong)態圖像(xiang)(xiang)。

諾貝爾生(sheng)物學(xue)或醫(yi)學(xue)獎獲得者愛德華·莫(mo)索爾（Edvard.I. Moser）博士曾稱這款顯微鏡是神經科(ke)學(xue)研究領(ling)域中(zhong)的一個“革命性”新工具。

持續深耕——拓寬腦科學研究的邊界，應用場景不斷升級

2021年，這(zhe)支北大(da)(da)團隊推出了第二(er)代微型化雙光子顯微鏡FHIRM-TPM 2.0，將(jiang)成像(xiang)視野擴大(da)(da)了7.8倍，成像(xiang)的(de)橫向分(fen)辨(bian)率(lv)、軸向分(fen)辨(bian)率(lv)比**代顯微鏡高(gao)約1.5倍，同(tong)時具備獲取大(da)(da)腦皮層上(shang)千個神經(jing)元功能信號的(de)三維成像(xiang)能力。

除在核心性能上實現升級外，新一代微型化雙光子顯微鏡采用整機一體化設計，滿足更小空間實驗室的應用。同時具有較強的兼容性，內置激光適配模塊，可匹配市面上所有品牌的飛秒激光器，以更強大的成像性能、更廣泛的適配性能及更便捷的操作性能為成像技術的發展帶來新的活力。

基于微(wei)型化(hua)雙光子顯微(wei)鏡，北大(da)團(tuan)隊(dui)與浙江(jiang)大(da)學的胡海嵐(lan)團(tuan)隊(dui)、中科院孫(sun)衍剛團(tuan)隊(dui)等開展合(he)作。如孫(sun)衍剛團(tuan)隊(dui)在研究癢(yang)覺感(gan)知(zhi)神(shen)經(jing)(jing)機(ji)制(zhi)，由于癢(yang)覺出現(xian)過程非常(chang)快、神(shen)經(jing)(jing)元發放也(ye)很快，而且不(bu)同比例的神(shen)經(jing)(jing)元在癢(yang)覺感(gan)知(zhi)的不(bu)同階段出現(xian)，這要(yao)求成(cheng)像設(she)備(bei)不(bu)僅需(xu)要(yao)快速記錄單個神(shen)經(jing)(jing)元，還需(xu)具備(bei)高空間分(fen)(fen)辨率以區分(fen)(fen)兩類神(shen)經(jing)(jing)元。

此前，大腦皮層對癢(yang)(yang)覺(jue)感(gan)知的(de)編碼機制(zhi)的(de)研(yan)究多(duo)在(zai)麻醉動物中(zhong)進(jin)行，這(zhe)種情況下動物無法通過(guo)(guo)抓撓行為報告對癢(yang)(yang)覺(jue)的(de)感(gan)知。通過(guo)(guo)微型化雙光子顯微鏡，孫衍剛團(tuan)隊在(zai)小鼠自由活動時實現了單細胞分辨率的(de)鈣成像，為癢(yang)(yang)覺(jue)機制(zhi)的(de)研(yan)究提供了新的(de)方(fang)案。

在應(ying)用場景上(shang)，北大團隊也一直在突破(po)極(ji)限(xian)。2022年，團隊攻克(ke)了航天極(ji)端環境機體應(ying)激與(yu)防(fang)護等多項技術(shu)難題，研(yan)制出(chu)空間站(zhan)雙(shuang)光子顯微鏡(jing)。據程和平院士此前(qian)的(de)介紹：“在軌實驗儀器設備對可(ke)靠性、體積(ji)、重量、抗沖擊(ji)和振(zhen)動性能等有(you)著更苛刻(ke)的(de)要(yao)求，要(yao)想研(yan)制出(chu)能夠進(jin)入太空的(de)雙(shuang)光子顯微鏡(jing)并非易事(shi)。”

近日，神舟十(shi)五號的(de)航(hang)天(tian)員使用其空間(jian)站雙光子顯微(wei)鏡，成功(gong)獲取皮膚表(biao)皮及真皮淺層的(de)三維圖像，可用于航(hang)天(tian)員的(de)在軌健(jian)康監(jian)測。

科研成果產業化的關鍵一步，

搭建可控的供應鏈

王(wang)愛民提出，由(you)于綜(zong)合技(ji)術等原因，目前(qian)全球范(fan)圍內為(wei)數不多的課題組在研究微(wei)型化雙光子顯微(wei)鏡(jing)，只有更多參與者加入，才能更快地推廣(guang)技(ji)術、做大產業。

創新技(ji)術的(de)大規模推廣離不(bu)開產(chan)(chan)業化。以(yi)中國科(ke)學(xue)(xue)院院士及(ji)北京大學(xue)(xue)生(sheng)(sheng)物學(xue)(xue)、醫學(xue)(xue)、物理學(xue)(xue)和生(sheng)(sheng)理學(xue)(xue)等多學(xue)(xue)科(ke)專(zhuan)家為背景(jing)(jing)(jing)成(cheng)立(li)的(de)北京超維景(jing)(jing)(jing)生(sheng)(sheng)物科(ke)技(ji)有限公(gong)司（以(yi)下簡(jian)稱“超維景(jing)(jing)(jing)”）實現(xian)了科(ke)研成(cheng)果的(de)產(chan)(chan)業轉化。目(mu)前，超維景(jing)(jing)(jing)在北京、南(nan)京兩地(di)的(de)團隊(dui)人(ren)數已超100人(ren)，吸(xi)引了在生(sheng)(sheng)產(chan)(chan)、注冊、市場推廣等領域經驗(yan)豐(feng)富的(de)產(chan)(chan)業人(ren)士加入(ru)。

從科研項目走向產業化，除了企業自身的技術積累、差異化產品創新、工藝流程控制外，可控的供應鏈是關鍵因素之一。

據王(wang)愛民回憶，曾(ceng)經我(wo)(wo)們做的**個(ge)“商業化試水(shui)”的項目是雙(shuang)光(guang)子光(guang)片(pian)顯(xian)微鏡，其中的一個(ge)核(he)心部件(jian)變焦透鏡只有一家美(mei)國公司可以(yi)提(ti)供，在我(wo)(wo)們做科研、小范圍應用時，可以(yi)正(zheng)常買到，但當(dang)我(wo)(wo)們決定產(chan)業化后，這(zhe)家美(mei)國公司便不(bu)提(ti)供了，這(zhe)也(ye)就直(zhi)接(jie)導致(zhi)項目“夭(yao)折”。

在此(ci)后(hou)的(de)產(chan)業化(hua)進程中，超(chao)維景(jing)選擇(ze)“自力(li)(li)更生”加“內外(wai)合(he)(he)力(li)(li)”的(de)模式。一是自主研發逐步實現雙光子(zi)顯微鏡(jing)產(chan)品(pin)核(he)心(xin)零(ling)部件國產(chan)化(hua)；二(er)是聯(lian)合(he)(he)國內相關產(chan)業的(de)參(can)與者，由他們根(gen)據需求(qiu)開(kai)發新技術(shu)。

目前，超維景已建立起可控的產業鏈，如飛秒激光器、空心光纖、微型化物鏡等都已實現國產化，為公司后續醫療產品線的發展打下堅實基礎，不僅在研發、生產等環節實現自主可控，還可大大降低生產成本。

兩條腿走路，

邁出科研設備的“舒適區”

王愛民提(ti)出：“中(zhong)國腦科學起(qi)步較晚，市場不(bu)足美國的十分之一，但(dan)是2021年(nian)中(zhong)國腦計(ji)(ji)劃正式啟動，預計(ji)(ji)5年(nian)500億的投(tou)入。” 同時，雙(shuang)光子(zi)顯(xian)微(wei)成像(xiang)應(ying)用(yong)于在體病理(li)的研究(jiu)和應(ying)用(yong)工作在全球(qiu)也(ye)開展(zhan)近20年(nian)，雙(shuang)光子(zi)作為活體成像(xiang)利器應(ying)用(yong)于臨床診斷研究(jiu)也(ye)展(zhan)示了應(ying)用(yong)潛(qian)力。超(chao)維(wei)景堅(jian)持科研設備、醫療器械兩條腿走(zou)路，力求實現從(cong)動物到人，更(geng)大程度(du)地造(zao)福人體健康。

手持式皮膚生物細胞檢測儀是公司的首次“試水”。該產品以微型化雙光子顯微成像技術為基礎，實現在體、原位、無創、無標記的微納米級顯微成像，細胞、彈性纖維(wei)、膠原纖維(wei)、代謝信息(xi)等清(qing)晰可見。

手持式皮膚生物細胞檢測儀主要有兩大應用市場。一是臨床的應用，在院內進行實時在體的檢測。目(mu)前院內疾病診斷的(de)(de)金標準(zhun)是(shi)病理檢查，需從人體切(qie)下一小(xiao)塊組織送檢，操作有創且需等待(dai)一段(duan)時間(jian)（一般是(shi)3-5天）才(cai)能(neng)得到檢查結果(guo)。而很多情況下臨床需要快速決策、定(ding)期監(jian)測，如黑(hei)色素(su)瘤、皮(pi)膚癌等定(ding)期檢查。通(tong)過手持式皮(pi)膚生物細胞檢測儀(yi)，醫(yi)生可隨時監(jian)測細胞形態(tai)的(de)(de)變化，觀(guan)察患者病情變化，以調整治療計劃(hua)。

二是皮膚功效檢測的(de)(de)應(ying)用(yong)，超維(wei)(wei)(wei)景正在開展皮膚(fu)圖譜研究(jiu)，可用(yong)于化妝(zhuang)品(pin)、醫(yi)美技術(shu)的(de)(de)評(ping)估。據王愛民(min)介紹，化妝(zhuang)品(pin)提(ti)到幫(bang)助(zhu)改善肌膚(fu)狀態，但其中并(bing)沒有客觀(guan)標準，我們可直(zhi)接基于對皮膚(fu)細(xi)胞的(de)(de)觀(guan)察，檢測其中的(de)(de)彈性纖維(wei)(wei)(wei)、膠原纖維(wei)(wei)(wei)，推出客觀(guan)的(de)(de)皮膚(fu)年齡標準，用(yong)于評(ping)估化妝(zhuang)品(pin)的(de)(de)有效性。

在醫療領(ling)域，超維景(jing)在開發3D 4K熒光內(nei)窺(kui)鏡，在傳統內(nei)窺(kui)鏡的基礎(chu)上加入細胞(bao)成像(xiang)功(gong)能，使醫生看到更(geng)多信息(xi)，進一(yi)步推動**診斷。

王(wang)愛民提到(dao)：“新技術的(de)推廣市場(chang)教育非(fei)常重要，尤其是在保守謹慎的(de)醫(yi)療市場(chang)。我(wo)們要先充分(fen)理(li)解醫(yi)生的(de)使用習慣(guan)再去(qu)設計產(chan)(chan)品(pin)，創(chuang)新技術要變成對醫(yi)生而言真正好用的(de)產(chan)(chan)品(pin)。”目前，超維景正在跟(gen)301醫(yi)院合作，開發一次性內(nei)窺鏡，用于消化道(dao)早癌的(de)篩查、診斷；公司也在與協和醫(yi)院婦(fu)產(chan)(chan)科聯(lian)合開展宮頸(jing)癌早篩方面(mian)的(de)研究(jiu)。

腦科(ke)學，無(wu)疑是近年來醫療領域(yu)*火的命題之一。

人類腦部結構錯(cuo)綜(zong)復雜(za)，包含千(qian)億個神經元，至今科學(xue)家都(dou)仍在(zai)探索(suo)情(qing)緒、感情(qing)等(deng)(deng)發生(sheng)機制。成(cheng)像(xiang)技術是腦科學(xue)研(yan)究發展的關鍵。從(cong)CT、MRI到PET等(deng)(deng)成(cheng)像(xiang)技術，都(dou)是為(wei)做到“眼見(jian)為(wei)實”。人類不斷追求，在(zai)新鮮樣本、甚至是活體(ti)上直接(jie)進行高(gao)分辨(bian)率成(cheng)像(xiang)。多光子顯微成(cheng)像(xiang)技術在(zai)成(cheng)像(xiang)分辨(bian)率、速度、深度等(deng)(deng)多方面具有較大優勢，賦能腦科學(xue)研(yan)究。

同時將進一步揭示腦疾病發病機制(zhi)及(ji)指導(dao)檢(jian)測治(zhi)療(liao)方(fang)法(fa)的(de)開發。如癲(dian)癇、帕金森、阿(a)爾茲(zi)海(hai)默等神(shen)經(jing)系統疾病所帶來的(de)社(she)(she)會負(fu)擔(dan)、經(jing)濟負(fu)擔(dan)重，且持續周期長(chang)，缺少有效的(de)治(zhi)療(liao)手(shou)段(duan)。如果能(neng)在疾病機制(zhi)上有一些(xie)新的(de)發現，做到早(zao)防早(zao)治(zhi)，可(ke)極大地減(jian)輕社(she)(she)會負(fu)擔(dan)。

再(zai)者，成像(xiang)技(ji)術必將(jiang)與數字技(ji)術特(te)別(bie)是人工(gong)智能技(ji)術緊密結合，“AI+”的(de)成像(xiang)系統將(jiang)進一步提高臨床醫生的(de)診療水平。

綜合來看，多光子顯微成(cheng)像(xiang)技術擁(yong)有“科研(yan)(yan)+臨床”的廣闊應用空間，將成(cheng)為(wei)人類在腦科學研(yan)(yan)究海(hai)域中的一座燈(deng)塔，照亮更(geng)多隱秘的角落。

參考文章：

《你為什么會(hui)癢？中(zhong)科院研(yan)究(jiu)揭示癢覺(jue)表(biao)征和感知的神經機制》——澎湃新聞

《【科技前沿】北京大學程和平/王愛民團隊研制成功微型化三(san)光子(zi)顯微鏡》——中國生物物理學會(hui)

《多光子顯微成像技術在腦(nao)部疾(ji)病研究中的應用》——黃燕霞、周(zhou)非凡、周(zhou)婷(ting)、許皓、林丹(dan)櫻、屈軍樂(le)

《Miniature three-photon microscopy maximized for scattered fluorescence collection 》——《Nature Methods》

《世(shi)界首次！北大研制(zhi)空間站雙光(guang)子顯微鏡獲取(qu)航天員皮膚三維圖像》——北京大學

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