熒光顯微鏡不是通過普通光源的照射來觀察標本，而是利用一定波長的光（通常是紫外光、藍紫光）在顯微鏡下激發標本中的熒光物質發出熒光，所以，熒(ying)光(guang)顯(xian)微鏡(jing)光源的作用不是直接照射，而是作為能量源激發標本內部的熒光物質。我們之所以能觀察到標本，是由于光源的照射，而是標本中的熒光物質吸收激發光能后呈現的熒光現象。

熒光顯微(wei)鏡(jing)的(de)原理是什么?

與普通光學顯微鏡不同，熒光顯微(wei)鏡不是通過普通光源的照射來觀察標本，而是利用一定波長的光（通常是紫外光、藍紫光）在顯微鏡下激發標本中的熒光物質發出熒光，所以，熒光顯微鏡光源的作用不是直接照射，而是作為能量源激發標本內部的熒光物質。我們之所以能觀察到標本，是由于光源的照射，而是標本中的熒光物質吸收激發光能后呈現的熒光現象。

由此可見，熒(ying)光(guang)(guang)顯(xian)微(wei)鏡(jing)的(de)(de)主要(yao)特點是它的(de)(de)光(guang)(guang)源可以在特定波長范圍內提供大量的(de)(de)激發光(guang)(guang)，使被測(ce)(ce)樣品(pin)中(zhong)的(de)(de)熒(ying)光(guang)(guang)物(wu)質能夠獲得被測(ce)(ce)物(wu)的(de)(de)激發光(guang)(guang)。必(bi)要(yao)的(de)(de)強(qiang)度。同時，熒(ying)光(guang)(guang)顯(xian)微(wei)鏡(jing)必(bi)須有相應的(de)(de)濾光(guang)(guang)系統。

熒光顯微鏡是免疫熒光(guang)組織化學(xue)的(de)重(zhong)要工(gong)具。它由超高壓光(guang)源、濾(lv)光(guang)系(xi)統(tong)（包括(kuo)激發和加壓濾(lv)板）、光(guang)學(xue)系(xi)統(tong)和照相系(xi)統(tong)等主要部(bu)件組成(cheng)。它利用(yong)一定波(bo)長的(de)光(guang)激發標本發射(she)熒光(guang)。

激(ji)(ji)發(fa)(fa)(fa)熒光(guang)(guang)(guang)的(de)(de)(de)方(fang)式：根(gen)據光(guang)(guang)(guang)的(de)(de)(de)波長范圍分(fen)為UV激(ji)(ji)發(fa)(fa)(fa)法(fa)(fa)（使用(yong)紫外照射(she)法(fa)(fa)）和(he)BV激(ji)(ji)發(fa)(fa)(fa)法(fa)(fa)（使用(yong)藍(lan)紫光(guang)(guang)(guang)）。紫外激(ji)(ji)發(fa)(fa)(fa)法(fa)(fa)使用(yong)短(duan)于(yu) 400 nm 的(de)(de)(de)近紫外光(guang)(guang)(guang)進行激(ji)(ji)發(fa)(fa)(fa)。該方(fang)法(fa)(fa)沒(mei)有可見的(de)(de)(de)激(ji)(ji)發(fa)(fa)(fa)光(guang)(guang)(guang)，因此觀察到的(de)(de)(de)熒光(guang)(guang)(guang)表現出(chu)染料的(de)(de)(de)固有熒光(guang)(guang)(guang)，很容易區分(fen)標本上的(de)(de)(de)特異性熒光(guang)(guang)(guang)和(he)背(bei)景組織的(de)(de)(de)自發(fa)(fa)(fa)熒光(guang)(guang)(guang)。

BV激(ji)發(fa)(fa)法(fa)(fa)是從紫外光(guang)(guang)(guang)激(ji)發(fa)(fa)到以(yi)404nm和(he)434nm為(wei)中(zhong)心(xin)的(de)(de)(de)藍(lan)光(guang)(guang)(guang)。這種方(fang)法(fa)(fa)使用(yong)(yong)(yong)藍(lan)光(guang)(guang)(guang)照射(she)標本，因(yin)此熒光(guang)(guang)(guang)觀察系統的(de)(de)(de)截止濾光(guang)(guang)(guang)片(pian)必(bi)須使用(yong)(yong)(yong)能(neng)夠(gou)完(wan)全阻擋藍(lan)光(guang)(guang)(guang)并完(wan)全通過所(suo)需的(de)(de)(de)綠色和(he)黃色熒光(guang)(guang)(guang)的(de)(de)(de)濾光(guang)(guang)(guang)片(pian)。用(yong)(yong)(yong)于(yu)熒光(guang)(guang)(guang)抗(kang)體(ti)測(ce)定(ding)的(de)(de)(de)熒光(guang)(guang)(guang)染(ran)料。激(ji)發(fa)(fa)光(guang)(guang)(guang)的(de)(de)(de)Z大吸收波(bo)長與熒光(guang)(guang)(guang)的(de)(de)(de)Z大發(fa)(fa)射(she)波(bo)長比較接近，所(suo)以(yi)BV激(ji)發(fa)(fa)法(fa)(fa)中(zhong)使用(yong)(yong)(yong)的(de)(de)(de)濾光(guang)(guang)(guang)片(pian)必(bi)須使用(yong)(yong)(yong)銳(rui)截止濾光(guang)(guang)(guang)片(pian)。該方(fang)法(fa)(fa)可以(yi)使用(yong)(yong)(yong)藍(lan)光(guang)(guang)(guang)作為(wei)激(ji)發(fa)(fa)光(guang)(guang)(guang)，因(yin)此熒光(guang)(guang)(guang)染(ran)料的(de)(de)(de)吸收效(xiao)率高，可以(yi)獲得(de)更亮的(de)(de)(de)圖(tu)像。缺(que)點(dian)是500nm以(yi)下(xia)看不到熒光(guang)(guang)(guang)，500nm以(yi)上會使整個圖(tu)像呈現黃色。在熒光(guang)(guang)(guang)抗(kang)體(ti)法(fa)(fa)中(zhong)，大部分熒光(guang)(guang)(guang)染(ran)料都是獨特的(de)(de)(de)。因(yin)此，在討論細微(wei)特異(yi)性時，上述 BV 激(ji)發(fa)(fa)方(fang)法(fa)(fa)的(de)(de)(de)缺(que)點(dian)往往影響很大。

綜上所述，熒光顯微鏡的照明根據聚光鏡的結構和激發光的波長可以分為以下三點。

1.從熒光(guang)圖像(xiang)的對比度要求來看(kan)，紫外激發的暗場聚光(guang)鏡適合照明(ming)。

2.考慮到圖像(xiang)的亮(liang)度，BV激發濾光(guang)片的暗場觀察效率高。

3.UV激發濾光片暗場觀察和BV激發暗場聚光鏡照明的特點可以說是介于這兩種照明方式之間，但前者的濾光片暗場特性更強，顯示的圖像更亮，對比度小；后者保留了暗場光路的特性，因此顯示圖像更暗，對比度提高。實際使用熒光顯微鏡時，應使用適合標本要求的照明方法進行觀察。

必(bi)須指出的是，即(ji)使(shi)是用對比度(du)好的紫(zi)外激(ji)發(fa)暗(an)場聚光(guang)(guang)器照射(she)時(shi)，被(bei)試樣折(zhe)射(she)或散射(she)的部分紫(zi)外激(ji)發(fa)光(guang)(guang)也會(hui)進入物鏡，使(shi)加膠面和(he)光(guang)(guang)學(xue)玻(bo)璃中的加膠面光(guang)(guang)學(xue)系統會(hui)受(shou)到激(ji)發(fa)的影響(xiang)，產生(sheng)的自發(fa)熒光(guang)(guang)會(hui)使(shi)圖像的響(xiang)應變差。因(yin)此(ci)，必(bi)須在目鏡前使(shi)用吸收紫(zi)外線的濾光(guang)(guang)片(pian)(pian)作為截止(zhi)濾光(guang)(guang)片(pian)(pian)。