倒置熒光顯微鏡是用人(ren)眼不可見的(de)(de)一定波長的(de)(de)紫外線(xian)作光源照射(she)被檢物(wu)體(ti)，使(shi)之受激發后而產生(sheng)(sheng)(sheng)人(ren)眼可見的(de)(de)熒光,然(ran)后再經顯微鏡成像系統圖像放(fang)大來進行鏡檢。熒光顯微術是生(sheng)(sheng)(sheng)物(wu),醫學(xue)中的(de)(de)重(zhong)要研究方法，如(ru)對生(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)組織、人(ren)體(ti)生(sheng)(sheng)(sheng)理、病理、微生(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)檢測、生(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)制藥、食品(pin)飲料(liao)、化(hua)(hua)工化(hua)(hua)學(xue)等(deng)諸方面(mian)的(de)(de)鑒定等(deng)。

一、熒光

普通光是由發光體質點的熱運動所引起的輻射；而熒光是非溫度輻射，是一種冷光。熒光有多種，如光化熒光（由光源激發而產生的熒光），放射出熒光（由放射性物質激發而產生的熒光）。生物熒光（如磷的氧化時發出的熒光），等等。而倒置熒光顯微鏡則是利用光(guang)(guang)化熒(ying)光(guang)(guang)這原(yuan)理設計制(zhi)造，達到熒(ying)光(guang)(guang)顯微術鏡檢(jian)的目的。

由于倒置熒光顯微鏡的(de)光源是(shi)利用人眼不可見(jian)的(de)短波(bo)光，因(yin)而就大大提高(gao)了(le)物鏡的(de)分(fen)辨(bian)率，圖像與背(bei)景的(de)反差亦甚為明顯。

二、熒光現象

將熒(ying)(ying)光(guang)(guang)物體(ti)放(fang)到光(guang)(guang)譜中的(de)(de)各色區域，就(jiu)可(ke)(ke)發(fa)現引(yin)起(qi)熒(ying)(ying)光(guang)(guang)更(geng)有效的(de)(de)光(guang)(guang)線(xian)是(shi)光(guang)(guang)譜上(shang)波(bo)(bo)(bo)長(chang)較短的(de)(de)區域，即(ji)近紫(zi)外線(xian)區域，波(bo)(bo)(bo)長(chang)約為320-400nm。這種現象的(de)(de)實質是(shi)分子吸收了短光(guang)(guang)的(de)(de)能量（波(bo)(bo)(bo)長(chang)越短，光(guang)(guang)能越強），又以(yi)發(fa)光(guang)(guang)的(de)(de)形式以(yi)波(bo)(bo)(bo)長(chang)較長(chang)和熒(ying)(ying)光(guang)(guang)射出，而(er)為人(ren)眼可(ke)(ke)見，這就(jiu)是(shi)熒(ying)(ying)光(guang)(guang)現象。熒(ying)(ying)光(guang)(guang)接近可(ke)(ke)見光(guang)(guang)的(de)(de)紅(hong)光(guang)(guang)端，大部分的(de)(de)熒(ying)(ying)光(guang)(guang)現象是(shi)符合這一規律的(de)(de)。

熒光現象可分為兩(liang)種：

1.**次熒(ying)光(guang)(guang)現象；又稱固有熒(ying)光(guang)(guang)或自發(fa)熒(ying)光(guang)(guang)，當經紫外線的照(zhao)射后(hou)，就(jiu)能發(fa)出熒(ying)光(guang)(guang)的物質；

2.第二次熒(ying)(ying)(ying)光現(xian)象：又稱激(ji)發熒(ying)(ying)(ying)光，當經紫(zi)外線(xian)照射后不能或(huo)只部分(fen)發生微弱的熒(ying)(ying)(ying)光，這樣就需(xu)先用熒(ying)(ying)(ying)光素處理(li)，再(zai)經紫(zi)外線(xian)照射才能發生熒(ying)(ying)(ying)光，這是因(yin)組織(zhi)內吸附(fu)或(huo)溶解有(you)熒(ying)(ying)(ying)光素的緣故。

三、倒置熒光顯微鏡的原理

濾色塊是倒置熒光顯微鏡的(de)重(zhong)要部位，其核心部件由激發光濾(lv)色片（firstbarrierfilter）、發射光濾(lv)色片（secondbarrierfilter）和半(ban)透半(ban)反濾(lv)色片(beam-splittingmirror)組成。

1．激(ji)發光(guang)(guang)濾色片及發射光(guang)(guang)濾色片：根(gen)據光(guang)(guang)源和(he)熒(ying)光(guang)(guang)色素的特點，通常(chang)選(xuan)用以下三類配套，提供一定波長范(fan)圍的激(ji)發光(guang)(guang)，并使樣品激(ji)發出的熒(ying)光(guang)(guang)透過，到達目鏡成(cheng)像(xiang)。

紫(zi)外(wai)光激發(fa)：激發(fa)光濾色片(pian)可使紫(zi)外(wai)光透過，阻(zu)擋400nm以上的可見光通過。與(yu)之相應的發(fa)射(she)光濾色片(pian)可允許藍光通過，視野內(nei)的光呈藍色，如應用于(yu)DAPI染色。

藍(lan)光激發：激發光濾(lv)色(se)片可(ke)使藍(lan)光通(tong)過，阻擋(dang)其他波段的光。與之相(xiang)應的發射光濾(lv)色(se)片可(ke)允許綠光通(tong)過，如GFP染(ran)色(se)標記(ji)。

綠光(guang)(guang)激(ji)發(fa)：激(ji)發(fa)光(guang)(guang)濾色片使綠光(guang)(guang)通過，阻擋其他波段的光(guang)(guang)。與之相應(ying)的發(fa)射光(guang)(guang)濾色片通常(chang)可允許紅光(guang)(guang)通過，如Rhodamine染(ran)色。

2．半透半反濾色片(pian)：它的(de)作用是完(wan)全(quan)阻擋激發(fa)(fa)光通過，而將其(qi)反射；并透過相應(ying)波長(chang)范圍(wei)的(de)發(fa)(fa)射光。其(qi)型(xing)號與激發(fa)(fa)光濾色片(pian)和發(fa)(fa)射光濾色片(pian)相對應(ying)。

3.光(guang)(guang)路：光(guang)(guang)線在熒(ying)光(guang)(guang)濾色塊中(zhong)的(de)傳播光(guang)(guang)路為：反射(she)光(guang)(guang)濾光(guang)(guang)片只允許(xu)光(guang)(guang)源中(zhong)特定波長的(de)光(guang)(guang)線透(tou)過(guo)，這部分激發光(guang)(guang)到達(da)(da)半透(tou)半返(fan)濾色片時(shi)被反射(she)后通過(guo)物鏡(jing)照(zhao)射(she)到樣(yang)品上，樣(yang)品中(zhong)的(de)熒(ying)光(guang)(guang)基團被激發光(guang)(guang)激發，發射(she)出長波長的(de)熒(ying)光(guang)(guang)；發射(she)光(guang)(guang)通過(guo)物鏡(jing)，透(tou)過(guo)半透(tou)半反濾色片，到達(da)(da)發射(she)光(guang)(guang)濾色片，此時(shi)又只有特定波長的(de)光(guang)(guang)線透(tou)過(guo)，更后通過(guo)目鏡(jing)被我(wo)們(men)肉眼看(kan)到的(de)就是樣(yang)品中(zhong)的(de)熒(ying)光(guang)(guang)了。