倒置熒光顯微鏡是用人眼(yan)不可(ke)見的(de)(de)一定波長的(de)(de)紫外線作光(guang)源照(zhao)射被檢物(wu)體(ti)，使之受激(ji)發后(hou)而產生(sheng)人眼(yan)可(ke)見的(de)(de)熒(ying)光(guang),然后(hou)再經顯微(wei)(wei)鏡(jing)成像(xiang)系統(tong)圖像(xiang)放大來進(jin)行(xing)鏡(jing)檢。熒(ying)光(guang)顯微(wei)(wei)術(shu)是生(sheng)物(wu),醫學中(zhong)的(de)(de)重要研究(jiu)方(fang)法，如對生(sheng)物(wu)組(zu)織、人體(ti)生(sheng)理(li)、病理(li)、微(wei)(wei)生(sheng)物(wu)檢測(ce)、生(sheng)物(wu)制藥、食品飲(yin)料(liao)、化(hua)工(gong)化(hua)學等諸方(fang)面的(de)(de)鑒(jian)定等。

一、熒光

普通光是由發光體質點的熱運動所引起的輻射；而熒光是非溫度輻射，是一種冷光。熒光有多種，如光化熒光（由光源激發而產生的熒光），放射出熒光（由放射性物質激發而產生的熒光）。生物熒光（如磷的氧化時發出的熒光），等等。而倒置熒光顯微鏡則是利用光化熒(ying)光這原理設計制造，達(da)到熒(ying)光顯微術(shu)鏡(jing)檢的(de)目(mu)的(de)。

由于倒置熒光顯微鏡的(de)(de)光源是利用人眼不可見的(de)(de)短波(bo)光，因而就大(da)大(da)提高了物鏡的(de)(de)分(fen)辨(bian)率，圖(tu)像與背景的(de)(de)反差亦甚為明顯。

二、熒光現象

將熒(ying)光(guang)(guang)物體(ti)放到光(guang)(guang)譜(pu)中的(de)(de)(de)各色區(qu)域，就可(ke)發現(xian)引起熒(ying)光(guang)(guang)更有(you)效的(de)(de)(de)光(guang)(guang)線(xian)是光(guang)(guang)譜(pu)上(shang)波(bo)長(chang)較(jiao)短的(de)(de)(de)區(qu)域，即近紫外線(xian)區(qu)域，波(bo)長(chang)約為320-400nm。這種現(xian)象的(de)(de)(de)實質是分子吸收了短光(guang)(guang)的(de)(de)(de)能(neng)量(liang)（波(bo)長(chang)越(yue)短，光(guang)(guang)能(neng)越(yue)強），又(you)以(yi)發光(guang)(guang)的(de)(de)(de)形式以(yi)波(bo)長(chang)較(jiao)長(chang)和熒(ying)光(guang)(guang)射出，而為人眼可(ke)見，這就是熒(ying)光(guang)(guang)現(xian)象。熒(ying)光(guang)(guang)接近可(ke)見光(guang)(guang)的(de)(de)(de)紅(hong)光(guang)(guang)端，大部分的(de)(de)(de)熒(ying)光(guang)(guang)現(xian)象是符合這一規律的(de)(de)(de)。

熒光現(xian)象可分為兩種：

1.**次(ci)熒(ying)光(guang)(guang)現象；又稱固有熒(ying)光(guang)(guang)或自(zi)發熒(ying)光(guang)(guang)，當經紫外線的(de)照射后，就能發出熒(ying)光(guang)(guang)的(de)物質；

2.第二次熒(ying)(ying)光(guang)現象：又稱激發(fa)熒(ying)(ying)光(guang)，當經紫外線照(zhao)射后不能或只(zhi)部分發(fa)生(sheng)微弱的(de)熒(ying)(ying)光(guang)，這樣就需(xu)先用熒(ying)(ying)光(guang)素(su)處理，再經紫外線照(zhao)射才(cai)能發(fa)生(sheng)熒(ying)(ying)光(guang)，這是(shi)因組織(zhi)內吸(xi)附或溶解有熒(ying)(ying)光(guang)素(su)的(de)緣故。

三、倒置熒光顯微鏡的原理

濾色塊是倒置熒光顯微鏡的重要部(bu)(bu)位，其核(he)心部(bu)(bu)件由激發光濾(lv)色(se)片(pian)（firstbarrierfilter）、發射(she)光濾(lv)色(se)片(pian)（secondbarrierfilter）和半透半反濾(lv)色(se)片(pian)(beam-splittingmirror)組成。

1．激(ji)發光濾(lv)色片(pian)及發射光濾(lv)色片(pian)：根據光源和熒光色素的特點，通常選用以下(xia)三類(lei)配套，提供一定(ding)波長(chang)范圍的激(ji)發光，并使樣品激(ji)發出的熒光透過，到(dao)達目(mu)鏡成像。

紫外光(guang)激發(fa)：激發(fa)光(guang)濾(lv)色片可(ke)使紫外光(guang)透(tou)過(guo)，阻擋(dang)400nm以上的可(ke)見(jian)光(guang)通過(guo)。與之(zhi)相應(ying)的發(fa)射光(guang)濾(lv)色片可(ke)允許藍光(guang)通過(guo)，視(shi)野內的光(guang)呈藍色，如(ru)應(ying)用于DAPI染色。

藍光(guang)激發：激發光(guang)濾色片可(ke)(ke)使藍光(guang)通(tong)(tong)過，阻擋其他波段的(de)光(guang)。與之相應的(de)發射光(guang)濾色片可(ke)(ke)允(yun)許綠光(guang)通(tong)(tong)過，如GFP染色標記(ji)。

綠光(guang)激(ji)(ji)發：激(ji)(ji)發光(guang)濾(lv)色片使綠光(guang)通(tong)過，阻擋其他波段的(de)(de)光(guang)。與之相應的(de)(de)發射光(guang)濾(lv)色片通(tong)常可允(yun)許紅光(guang)通(tong)過，如Rhodamine染色。

2．半(ban)透半(ban)反濾色(se)片：它的(de)作(zuo)用(yong)是完全(quan)阻擋(dang)激發(fa)光(guang)通過，而(er)將(jiang)其反射(she)(she)；并(bing)透過相(xiang)應(ying)波長(chang)范圍的(de)發(fa)射(she)(she)光(guang)。其型號與激發(fa)光(guang)濾色(se)片和(he)發(fa)射(she)(she)光(guang)濾色(se)片相(xiang)對應(ying)。

3.光(guang)(guang)(guang)路(lu)：光(guang)(guang)(guang)線在(zai)熒光(guang)(guang)(guang)濾(lv)色(se)(se)塊中(zhong)(zhong)的傳播光(guang)(guang)(guang)路(lu)為：反射(she)光(guang)(guang)(guang)濾(lv)光(guang)(guang)(guang)片只允(yun)許光(guang)(guang)(guang)源中(zhong)(zhong)特定波(bo)(bo)長(chang)的光(guang)(guang)(guang)線透過(guo)，這部分(fen)激(ji)發(fa)光(guang)(guang)(guang)到(dao)(dao)達半(ban)透半(ban)返(fan)濾(lv)色(se)(se)片時被反射(she)后(hou)通(tong)過(guo)物(wu)鏡(jing)照(zhao)射(she)到(dao)(dao)樣品(pin)(pin)上，樣品(pin)(pin)中(zhong)(zhong)的熒光(guang)(guang)(guang)基團(tuan)被激(ji)發(fa)光(guang)(guang)(guang)激(ji)發(fa)，發(fa)射(she)出長(chang)波(bo)(bo)長(chang)的熒光(guang)(guang)(guang)；發(fa)射(she)光(guang)(guang)(guang)通(tong)過(guo)物(wu)鏡(jing)，透過(guo)半(ban)透半(ban)反濾(lv)色(se)(se)片，到(dao)(dao)達發(fa)射(she)光(guang)(guang)(guang)濾(lv)色(se)(se)片，此時又只有特定波(bo)(bo)長(chang)的光(guang)(guang)(guang)線透過(guo)，更后(hou)通(tong)過(guo)目鏡(jing)被我(wo)們肉眼看到(dao)(dao)的就是樣品(pin)(pin)中(zhong)(zhong)的熒光(guang)(guang)(guang)了。