熒光樣本制作所需材料(liao)

(一)載玻片

載玻片(pian)厚(hou)度(du)應在0.8～1.2mm之間，太厚(hou)的坡片(pian)，一方面光(guang)(guang)吸收多(duo)，另一方面不能使激發光(guang)(guang)在標本上聚(ju)集。載玻片(pian)要光(guang)(guang)潔，厚(hou)度(du)均勻，無(wu)明顯自發熒光(guang)(guang)。有時需用(yong)石(shi)英玻璃載玻片(pian)。

(二)蓋玻片

蓋玻(bo)片厚度在0.17mm左右，光潔。為了加強激(ji)發(fa)光，也可用干(gan)涉(she)蓋玻(bo)片，這是一種特制的表面鍍有(you)若干(gan)層(ceng)對不(bu)同波長的光起(qi)不(bu)同干(gan)涉(she)作用的物(wu)質(如氟(fu)化鎂)的蓋玻(bo)片，它可以(yi)使熒(ying)光順(shun)利通過，而反射激(ji)發(fa)光，這種反射的激(ji)發(fa)光可激(ji)發(fa)標本。

(三)標本

組(zu)織(zhi)切片或其他標本不(bu)能太(tai)厚，如(ru)太(tai)厚激發光大部(bu)(bu)分(fen)消(xiao)耗(hao)在標本下部(bu)(bu)，而物(wu)鏡直接觀察到(dao)的上(shang)部(bu)(bu)不(bu)充分(fen)激發。另外，細胞重迭或雜質掩蓋(gai)，影響判斷。

(四)封裱劑

封裱劑常用甘油，要無(wu)自發(fa)熒光，無(wu)色(se)透明，熒光的亮度在pH8.5～9.5時較亮，不(bu)易(yi)很(hen)快褪去。所以，常用甘油和(he)0.5mol/l pH9.0～9.5的碳酸鹽緩沖液的等量混合液作(zuo)封裱劑。

(五)鏡油

一般暗視野熒光顯微(wei)鏡和(he)用(yong)(yong)油(you)鏡(jing)觀察標本時(shi)，要使用(yong)(yong)鏡(jing)油(you)，請使用(yong)(yong)特(te)制的無(wu)熒光(guang)鏡(jing)油(you)，也(ye)可用(yong)(yong)上述甘油(you)代替，液體石(shi)蠟也(ye)可用(yong)(yong)，只是折光(guang)率較低，對(dui)圖像質量略(lve)有影(ying)響(xiang)。

熒光標(biao)本的制(zhi)作方法：

樣品(pin)須經過石(shi)蠟包埋切片，然后用(yong)鐵礬蘇木(mu)精(jing)染(ran)色，普通光(guang)鏡觀察效果還可以作熒(ying)光(guang)觀察需(xu)用(yong)熒(ying)光(guang)染(ran)料DAPI染(ran)色，

石蠟切片的過程：

1. 取材：刀片要求鋒利而薄,組(zu)織厚度(du)約2—3mm, 大小(xiao)1.5×1.5×0.2～0.3cm為宜(yi). 取材時(shi)間越(yue)快越(yue)好.

2. 固定(ding)(ding): 組織取下后應(ying)立即放入(ru)10%福爾馬林(lin)(相當(dang)于(yu)4%甲醛)固定(ding)(ding).

注意：(1). 固定液量(liang)應為組織塊體積的40倍(bei).

(2) 固定時間：固定時間與使用的固定液種類和組織塊(kuai)大小(xiao), 溫度等有關. 一般為3h-24h.

(3)固(gu)定(ding)溫度：大多可(ke)在室溫固(gu)定(ding), 在低溫(4℃)時(shi)間(jian)應延(yan)長.

(4)固定容器：固定容器應大些.

3. 漂洗(xi)(xi)：流水沖(chong)洗(xi)(xi)2—10h.

4. 脫水: 從低濃度酒精到高濃度酒精.

70%(數分鐘)→80%(60-120’)→90%(60-120’)→95%(60-120’)→95%(60-120’)→****(60-120’)→****(60-120’).

5. 透明: 組織(zhi)塊(kuai)(kuai)脫(tuo)水后要經過一(yi)種既能與酒精(jing)混合又能溶解石蠟(la)(la)的溶劑(ji), 而(er)使石蠟(la)(la)進入(ru)組織(zhi)塊(kuai)(kuai). 常用二甲苯, 一(yi)般浸泡(pao)30m即可.

6. 浸蠟(la): 組織經(jing)透明后在(zai)熔(rong)化的(de)石蠟(la)內(nei)浸漬的(de)過程稱浸蠟(la). 一般需(xu)經(jing)2—3次浸漬才(cai)能(neng)完成, 總時間(jian)為(wei)3—4h. 用于(yu)浸蠟(la)的(de)石蠟(la)熔(rong)點為(wei)52—56℃.

7. 包(bao)埋: 先將熔化的(de)(de)石蠟倒入包(bao)埋框(kuang)再用加熱的(de)(de)鑷子將組織塊放入. 包(bao)埋面要平整. 包(bao)埋后石蠟稍凝后可移(yi)入冷水或(huo)冰箱中加速(su)凝固.

8. 切(qie)(qie)片(pian)：修塊→切(qie)(qie)片(pian)→展片(pian)→撈片(pian)→烤(kao)片(pian).也可作冰凍(dong)切(qie)(qie)片(pian).

熒光染料的配制：

儲藏(zang)液：1mg/ml dapi(DMSO、去(qu)離子水、pbs都可(ke)以溶解)

工作液：通常1μg/ml

染色時(shi)須避光，10min左右

用pbs沖去多余染液即可觀察