熒光顯微鏡是目前生物、醫療等領域的基礎儀器，和一般的光學顯微鏡相比，它的原理和參數指標有所不同，今天我們就來帶大家了解下，熒光顯微鏡(jing)的原理及其應用。

一(yi)、熒光顯(xian)微鏡(jing)原理

在(zai)熒(ying)光顯微鏡中，熒(ying)光指的(de)是一種(zhong)光致發(fa)(fa)光現象：某些分子能吸收特定波長(chang)的(de)光線（激(ji)發(fa)(fa)光），然后再發(fa)(fa)射(she)出其(qi)他波長(chang)的(de)光線（發(fa)(fa)射(she)光）的(de)物理現象。這(zhe)種(zhong)分子稱為熒(ying)光團，熒(ying)光團的(de)激(ji)發(fa)(fa)光譜和(he)發(fa)(fa)射(she)光譜之間存在(zai)差值(zhi)，發(fa)(fa)射(she)光能量比發(fa)(fa)射(she)光低，波長(chang)比激(ji)發(fa)(fa)光長(chang)，這(zhe)個(ge)差值(zhi)稱為“斯(si)托克斯(si)位移”。

熒光現象有兩種：自發熒光與繼發熒光。自發熒光是指樣品自帶熒光團，經照射后就能發出熒光，如葉綠體；繼發熒光也稱二次熒光，樣品經照射后不能發出熒光，需先用熒光染料標記處理，再經照射才能發生熒光。熒光顯(xian)微鏡主要利用的是繼發熒光。

熒光成像包含激發和發射兩個過程，在熒光顯(xian)微(wei)鏡中體現為以下幾個關鍵部件：

（1）激發光源：提(ti)供激發光，有兩個主要指標 

光(guang)(guang)(guang)譜覆(fu)(fu)蓋(gai)：需(xu)要(yao)(yao)(yao)較寬光(guang)(guang)(guang)譜，以(yi)(yi)覆(fu)(fu)蓋(gai)發射光(guang)(guang)(guang)譜。不(bu)同(tong)熒光(guang)(guang)(guang)團需(xu)要(yao)(yao)(yao)不(bu)同(tong)波長(chang)的(de)(de)激(ji)發光(guang)(guang)(guang)，因此激(ji)發光(guang)(guang)(guang)源需(xu)要(yao)(yao)(yao)較寬的(de)(de)光(guang)(guang)(guang)譜，以(yi)(yi)覆(fu)(fu)蓋(gai)各種波長(chang)激(ji)發光(guang)(guang)(guang)的(de)(de)需(xu)要(yao)(yao)(yao)。如果(guo)應用(yong)(yong)場景限定為真菌檢查等，也可能采用(yong)(yong)窄光(guang)(guang)(guang)譜的(de)(de)單通道激(ji)發光(guang)(guang)(guang)源，但(dan)這種顯微鏡無(wu)法(fa)滿足研究等應用(yong)(yong)需(xu)要(yao)(yao)(yao)。

發射(she)(she)光強度：光源在不同波段的光強不同，理想(xiang)狀態(tai)下發射(she)(she)光高強的波段要匹配熒光染(ran)料的激發峰值，較高亮度的激發光可產生較強的熒光發射(she)(she)。現在(zai)主要用寬(kuan)光(guang)(guang)譜、高光(guang)(guang)強的(de)LED熒光(guang)(guang)光(guang)(guang)源

（2）激發塊：形成特異性激發/發射的濾光片組，在落射熒光顯(xian)微(wei)鏡中由三個部件組成

激(ji)發濾光(guang)片EX：只讓特(te)(te)定波長(chang)激(ji)發光(guang)通(tong)過(guo)，用以激(ji)發特(te)(te)定熒(ying)光(guang)染料

發射(she)(she)濾光片EM：匹配熒光染料特(te)性，只讓特(te)定(ding)波長的(de)發射(she)(she)熒光通(tong)過

二向分(fen)色鏡DM：反射激發(fa)波(bo)段的光(guang)，透過(guo)發(fa)射波(bo)段的光(guang)。這(zhe)是目(mu)前主(zhu)流的落射熒光(guang)顯(xian)微(wei)鏡都有(you)的部件，透射熒光(guang)顯(xian)微(wei)鏡沒有(you)這(zhe)個濾(lv)光(guang)片。

二、熒光顯微鏡的應用

1、在生物學領域，熒(ying)光(guang)顯微鏡(jing)借助熒(ying)光(guang)染料標記，可準確而詳(xiang)細地識別細胞和亞(ya)微觀細胞成分和活動。

2、在醫療領域，熒光顯(xian)微(wei)鏡可借助熒光試劑，來檢測細菌、病毒的存在和分布，或對外科目標進行輔助標記方便手術進行。

3、在(zai)礦物學(xue)領域，熒(ying)光顯微鏡常用(yong)于研究有自發熒(ying)光特性的物質，如瀝(li)青(qing)、石油、煤炭(tan)、氧化石墨烯等(deng)礦物。

4、在材料科學，熒(ying)光顯微(wei)鏡可用于紡織工業(ye)或造(zao)紙業(ye)來分析基于纖維的材料，包括(kuo)紡織品(pin)和紙張

5、在半導體領域，熒光顯(xian)微(wei)鏡也可用來觀測具有熒光特性的材料如磁珠等。

熒光顯微技術在生物學和醫療領域中應用是很廣泛也是很復雜的，樣品和目標從肉眼可見的模式生物如斑馬魚，到光學顯微鏡無法看清外形的細菌病毒，都會涉及。針對不同樣品和目標，需要考慮不同的熒光標記策略，一是熒光染料能標記的目標，二是熒光染料對應的激發特征，包括吸收光譜特征和發射光譜特征。借助熒光染料，熒(ying)光顯微(wei)鏡能針對的目標不只局限于蛋白質，還可以包含核酸、聚糖，甚至鈣離子等非生物物質。